B016876 - TECNICHE IN BIOTECNOLOGIE I

Italiano

Come materiale didattico saranno fornite dai docenti le diapositive delle lezioni e i protocolli delle tecniche applicate durante le esercitazioni in laboratorio

Conoscenza e capacità di comprensione: L'obiettivo del corso è quello di fornire agli studenti una conoscenza teorico/pratica e capacità di comprendere ed interpretare le tecniche e tecnologie più diffuse (tradizionali ed innovative, a bassa/medio/alta produttività) nei laboratori di biologia molecolare.
Capacità di applicare conoscenza e comprensione:L'obiettivo principale è far acquisire agli studenti la capacità di identificare ed applicare le tecniche più diffuse per l'estrazione di acidi nucleici, loro valutazione qualitativa e quantitativa, loro amplificazione mediante reazione a catena della polimerasi, identificazione di varianti genetiche note e non note, valutazione della espressione genica, metodi di analisi di base di tali dati, clonaggio, trasferimento genico.

Lezioni teorico/pratiche ed esercitazioni in laboratorio e aula informatica. Durante le esercitazioni gli studenti applicano in prima persona alcune delle più comuni tecniche di biologia molecolare e cellulare. Gli studenti nella fase finale del periodo di esercitazioni vengono portati a visitare un laboratorio di biologia molecolare e cellulare dotato di tutte le tecniche e tecnologie tradizionali e di tecnologia ad alta produttività e automatizzata: e.g. estrattori di acidi nucleici automatici, sequenziamento di nuova (seconda e terza generazione), tecnologia Affymetrix

Prova di verifica scritta.
Domande a risposta multipla.
Le domande e le risposte proposte sono volte alla valutazione dell'apprendimento 1) delle conoscenze sui principi delle tecniche e tecnologie presentate nel corso delle lezioni frontali e 2) delle competenze sviluppate durante le esercitazioni in laboratorio

Parte 1
- Presentazione dei dispositivi di protezione personale (camici, guanti, mascherine, etc.) e istruzioni sulla buona pratica di laboratorio in biologia molecolare con particolare riferimento alla prevenzione della contaminazione, organizzazione del laboratorio.
-Corretto utilizzo delle pipette
-Principali dispositivi e consumabili (pipette, puntali, conetti, piastre, etc.)
- Estrazione di DNA genomico da vari materiali biologici: principi delle varie metodiche di estrazione del DNA genomico (fenolo/cloroformio, gel di silice, biglie magnetiche e salting out).
-Estrazione di RNA da vari materiali biologici
-Valutazione quantitativa e qualitativa di acidi nucleici
-Elettroforesi
-Conservazione degli acidi nucleici
-Automazione in biologia molecolare
-Polymerase Chain Reaction (PCR), fasi della PCR
-Disegno dei primer e Temperatura di annealing
-Metodiche per identificazione varianti genetiche non note (tecniche di screening, sequenziamento)
-Metodiche di genotipizzazione di varianti genetiche note (RFLP, real time PCR con sonde Taqman e sonde di ibridazione, test genetici point-of-care)
-Real time PCR per valutazione espressione genica
-Tecnologie ad alta produttività in biologia molecolare per l'identificazione di mutazioni/polimorfismi.
-Tecnologie microarray per i profili di espressione genica (analisi del trascrittoma).
-Tecnologie di sequenziamento ad alta produttività o sequenziamento di nuova generazione
-Metodi statistici e bioinformatici per l'interpretazione di semplici dati sperimentali

Ogni studente effettuerà in laboratorio la seguente attività pratica:
- Estrazione di DNA genomico con metodica salting out da sangue venoso periferico anticoagulato in EDTA.
- Valutazione quantitativa e qualitativa del DNA genomico mediante spettrofotometro (letture spettrofotometriche a lunghezza d'onda 260, 280 e 230 nm; rapporti 260/280 e 260/23; calcolo della concentrazione).
-Preparazione di diluizioni dei campioni o delle soluzioni a partire da concentrazioni note.
- Corsa elettroforetica degli acidi nucleici su gel di agarosio[(preparazione di gel a varie concentrazioni di agarosio, visualizzazione della corsa elettroforetica grazie a coloranti inerti come blu di bromofenolo-BPB, colorazione mediante coloranti intercalari come bromuro di etidio, utilizzo di ladder/marker (serie di frammenti a dimensione nota)].
- Valutazione della qualità del DNA genomico mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio allo 0,8%.
- Amplificazione di un tratto di DNA interessato dalla presenza di un polimorfismo di una singola base mediante tecnica PCR (allestimento della reazione, monitoraggio delle contaminazioni, utilizzo di termociclatori).
- Corsa elettroforetica dei prodotti PCR su gel di agarosio 2%.
- Genotipizzazione mediante tecnica RFLP (restrictionfragmentlenghtpolymorphism): digestione con enzima di restrizione di prodotti amplificati.
-Corsa elettroforetica dei prodotti digeriti e riconoscimento del genotipo di soggetti a genotipo noto e dei campioni estratti e processati durante l'esercitazione.
-Allestimento di un esperimento per la valutazione dell'efficienza di un saggio di espressione genica in real time PCR con sonde Taqman ed interpretazione del risultato
-Allestimento di una seduta di genotipizzazione mediante tecnologia real time PCR e specifiche sonde Taqman
-Visita di un laboratorio di genetica/biologia molecolare
-Esercizi di Statistica e Bioinformatica per l'interpretazione dei dati in aula di informatica

Parte 2
1. Plasmidi e clonaggio di un cDNA. Struttura di un vettore di espressione eucariotico. Tecniche di trasferimento genico. Esempio di un possibile esperimento di espressione ectopica di un recettore TK e di valutazione dell'espressione fenotipica (frontale).
2. Piastratura di batteri su agarosio al fine di isolare colonie singole. Inoculo in terreno liquido di una colonia isolata. Estrazione del plasmide mediante "miniprep" su colonna. Elettroforesi su gel di agarosio per controllare la presenza del plasmide e la qualità della preparazione (esercitazione).
3. Taglio del plasmide con enzima di restrizione. Controllo della presenza dell'inserto mediante elettroforesi su gel di agarosio. Rilevamento dell'inserimento di inserti singoli o duplici e della loro direzionalità mediante l'analisi di un tracciato elettroforetico. Osservazione al microscopio di vari tipi di linee cellulari di mammifero in coltura (esercitazione).
4. Risultati dell'esperimento di espressione ectopica del recettore TK. Discussione dell'attività pratica (frontale).
5. Esempi di indagine mediante l'utilizzo di trasferimento genico in cellule di mammifero in coltura: analisi di lavori pubblicati (prima parte, frontale).
6. Esempi di indagine mediante l'utilizzo di trasferimento genico in cellule di mammifero in coltura: analisi di lavori pubblicati (seconda parte, frontale).
7. Tecniche di trasferimento genico nel sistema di lievito: esempi applicativi (frontale)